PNA, stabilizzare e amplificare la correzione della proteina CFTR mutata: un approccio di farmacologia epigenetica
La regolazione dell’espressione di CFTR (la proteina difettosa in Fibrosi Cistica, CF) da parte di alcuni piccoli RNA con funzioni di controllo (denominati microRNA o miRNA) è importante in questa patologia. Lo studio si basa sulla modulazione “farmacologica” di alcuni miRNA regolanti CFTR, interferendo con le interazioni tra i miRNA e i loro bersagli molecolari (tra cui l’RNA messaggero per CFTR).
Ipotesi e obiettivi. (a) Identificazione e caratterizzazione di alcuni miRNA che regolano l’RNA messaggero per CFTR o altre proteine importanti in CF (modulatori di CFTR o fattori di trascrizione del gene CFTR); (b) modulazione dei miRNA usando “farmaci” chiamati acidi peptido-nucleici (PNA); (c) trattamenti combinati utilizzando i PNA in combinazione con noti correttori e potenziatori di CFTR; (d) caratterizzazione di miRNA presenti in quantità diverse nei fluidi biologici di pazienti affetti da CF.
Metodi essenziali. Sequenziamento dell’RNA e quantificazione dei miRNA attraverso tecniche basate sulla reazione di polimerizzazione a catena (RT-qPCR); analisi del contenuto della proteina CFTR con la tecnica del Western blotting.
Risultati preliminari. Il trattamento con PNA contro i miR-145-5p, miR-494-3p e miR-101-3p (tutti in grado di interagire con l’mRNA di CFTR) ha determinato l’aumento di CFTR, ottenuto anche usando PNA contro miR-335-5p, miR-96-5p e miR-183-5p, specifici per modulatori di CFTR. Un PNA che “maschera” i siti di legame del miR-145-5p presenti nell’mRNA di CFTR aumenta CFTR. Queste molecole sono state usate in combinazione con altri farmaci potenziatori e correttori di CFTR. Ad esempio, i livelli massimi di aumento di CFTR sono stati raggiunti combinando i PNA con i farmaci VX809 (Lumacaftor, un correttore di CFTR) e VX770 (Ivacaftor, un potenziatore di CFTR), ottenendo anche un miglioramento della funzionalità di CFTR. L’analisi degli effetti dei PNA sull’espressione genica “globale” ha dimostrato effetti selettivi. Abbiamo concluso la caratterizzazione di nuovi sistemi di veicolazione di PNA e miRNA all’interno delle cellule, basati su (a) nanoparticelle e (b) agenti trasfettanti multivalenti. Eterogeneità nelle quantità prodotte dei diversi miRNA è stata riscontrata in campioni di plasma di pazienti CF, suggerendo una strategia personalizzata per la terapia con miRNA.
Conclusioni. Messaggio chiave del progetto è che colpire miRNA regolanti CFTR è utile per modificare l’espressione genica in cellule CF (e in particolare per aumentare la stabilità/espressione dell’mRNA CFTR). Questo obiettivo terapeutico è molto importante per il trattamento della fibrosi cistica.
Contatti:
Roberto Gambari (email: gam@unife.it) e Alessia Finotti (email: alessia.finotti@unife.it)
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